Объем доза полимиксина В (16 мм). Анализы поглощения NPN и PI показывают, что Hill-Cec1 и Hill-Cec 10 может проницать как OM, так и IM P. aeruginosa. Большинство усилителей с характерным механизмом действия работают за счет снижения целостности бактериальных мембран путем, например, образования пор или полного (в течение 5 мин) и присутствует в несмертельных концентрациях, проницаемость мембраны, вероятно, напрямую связана с механизмом действия усилителей BSF, а не с вторичным эффектом гибели бактерий через другие, не связанные внутриклеточные механизмы (42).
Деполяризация цитоплазматической мембраны. Disc3(5), чувствительный к напряжению катионный краситель, использовали для изучения деполяризации цитоплазматической мембраны. В нормальных условиях краситель концентрируется в (гипер)поляризованной цитоплазматической мембране, что приводит к самозатуханию его флуоресценции. Однако при деполяризации DISC3(5) высвобождается в цитоплазму, вызывая увеличение флуоресценции (43). Как Hill-Cec1, так и Hill-Cec10 вызывают деполяризацию цитоплазматической мембраны P. aeruginosa, на что указывает увеличение флуоресценции DISC3(5) (рис. 5e и f). Деполяризация в значительной степени зависит от концентрации, хотя и более выражена для Hill-Cec10. При высоких концентрациях деполяризация цитоплазмы превышает деполяризацию полимиксина В (16 мм), особенно для Хилла-Cec1. Поскольку анализ поглощения PI показал, что кекропины проникают в IM, возможно что деполяризация мембраны в значительной степени вызвана повреждением мембраны.
ОБСУЖДЕНИЕ
Биологическая функция кекропинов у черной солдатской мухи. Являясь разлагателем биологических отходов, личинка BSF живет в тесном контакте с потенциально опасными микроорганизмами(16). Эволюционное расширение и диверсификация репертуара BSF AMP может объяснить их успешную колонизацию этих богатых микробами субстратов (8). После широкого антимикробного скрининга библиотеки пептидов BSF мы обнаружили большую часть активности находится в семействе кекропинов. За исключением Hill-Cec6, все они проявляли сильную активность в отношении грамотрицательных тест-штаммов при низких микромолярных концентрациях. Кекропин Усилители широко распространены среди отрядов насекомых и до сих пор были идентифицированы у жесткокрылых, двукрылых и чешуекрылых. Однако предполагается, что они вырабатываются всеми голометаболическими насекомыми, за исключением видов перепончатокрылых (4). Количество и разнообразие кекропинов, обнаруженных в этих насекомых, намекает на более сохраненные функции этих усилителей. В ЧФ усилители участвуют в поддержании и формирование бактериальных сообществ кишечника и поддержание эубиоза в кишечнике (8, 12), но кекропины могут играть и дополнительные биологические роли. Например, было показано, что кекропин B Aedes aegypti участвует в формировании кутикулы взрослых комаров (44). Нокдаун гена кекропина В у куколок привел к высокой смертности, деформированным взрослым особям и нарушению пластинок кутикулы с дезорганизованными хитиновыми фибриллами (44). Предполагается, что кекропин В действует путем усиления экспрессии профенолоксидаз, которые участвуют в формировании кутикулы. Профенолоксидазы также играют решающую роль в иммунитете насекомых. Ферменты, например, участвуют в индукции процесса меланизации, что приводит к инкапсуляции вторгающихся патогенов (45, 46). Потенциал кекропинов черной солдатской мухи в разработке лекарств. Деятельность против Грамотрицательные патогены кекропинов сделали их соединениями, представляющими интерес для разработки новых противомикробных препаратов (41). В этом исследовании мы выбрали два усилителя цекропина, Hill-Cec1 и Hill-Cec10, для характеристики in vitro. В соответствии с другими кекропинами, они обладают альфа-спиральным амфифатическим доменом и сильным положительным суммарным зарядом. Поскольку известно, что усилители токсичны для клеток человека из-за неспецифических мембранных взаимодействий, мы изучили их влияние на фибробласты легких и эритроциты (35). Оба пептида не проявляли признаков гемолиза in vitro или цитотоксичности. Антимикробная активность кекропинов была дополнительно изучена, и, помимо тест-штаммов E. coli и P. aeruginosa, кекропины были также активны в отношении других видов P. aeruginosa, включая штамм с множественной лекарственной устойчивостью и K. pneumoniae. Затем мы охарактеризовали антимикробный профиль Hill-Cec1 и Hill-Cec10 против P. aeruginosa более подробно. P. aeruginosa является условно-патогенным микроорганизмом, который является основной причиной внутрибольничных инфекций (47). Уязвимые пациенты, такие как больные муковисцидозом и ожоговыми ранами, особенно подвержены риску заражения синегнойной палочкой (47, 48). Ликвидация P. aeruginosa становится все более трудной из-за роста штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (49). Усилители, обладающие активностью против этих штаммов, устойчивых к лекарственным средствам, могут убивает бактерии P. aeruginosa в течение первых 30 минут воздействия. Однако для поддержания бактерицидной активности необходимы более высокие уровни (4-8 мм для Hill-Cec1, 16 мм или выше для Hill-Cec10). Бактерицидная активность была связана с проницаемостью мембран для других цекропинов (50, 51). Действительно, анализ поглощения NPN подтвердил, что Hill-Cec1 и Hill-Cec10 способны проникать в ОВ P. aeruginosa. В соответствии с кинетикой уничтожения, пептиды способны быстро разрушать ОМ (в течение 5 минут), но нуждаются в дополнительном- Микрофоны (2 мм для Hill-Cec1, 4 мм для Hill-Cec10) для достижения не менее 50% поглощения NPN. То Анализы PI и DISC3(5) показывают, что оба кекропина также способны воздействовать на внутреннюю цитоплазматическую мембрану. Разрушение мембран усилителями является одним из основных механизмов, препятствующих развитию резистентности патогенов (52, 53). Сочетание их активности против псевдомонад с множественной лекарственной устойчивостью, их низкой цитотоксичности, быстрого времени уничтожения и разрушающего мембраны механизма действия делает Hill-Cec1 и Hill-Cec10 - кандидаты на новый антисеудомональный препарат, предназначенный для лечения острых инфекций, таких как кожные или легочные инфекции (54, 55).
Наконец, была изучена антибиопленочная активность кекропинов. Образование биопленки P. aeruginosa может привести к стойким инфекциям, которые плохо поддаются лечению антибиотиками. Матрица биопленки может замедлять проникновение антибиотиков, в то время как сидячие бактерии переходят в состояние покоя, характеризующееся высокой устойчивостью к противомикробным препаратам (37). Двумя стратегиями борьбы с биопленками являются (i) предотвращение образования биопленок либо путем ингибирования бактериальной адгезии, либо путем уменьшения начального роста бактерий, и (ii) уничтожение зрелых биопленки (56). Обе стратегии были исследованы в рамках этого исследования. Холм-Cec1 и холм- Cec10 показали значительное снижение массы и жизнеспособности биопленок, когда их немедленно добавляли к планктонным бактериям P. aeruginosa. Бактерицидные концентрации кекропинов позволили добиться снижения образования биопленки на 75% или более, что указывает на то, что большая часть ингибирующего действия пептидов напрямую связана с их активностью в отношении планктонных бактерий. Кекропины с ингибирующей активностью могут быть полезны для предотвращать образование биопленок после операции или в качестве покрытия на медицинских устройствах (57-59). Когда пептиды добавляли к 16-часовым зрелым биопленкам, при концентрациях до 128 мм не наблюдалось существенного влияния на жизнеспособность биопленок. Возможно, их высокий положительный заряд приводит к электростатическому взаимодействию с анионными полимерами в матрице биопленки, в результате чего они оказываются в ловушке (60). Однако для некоторых других кекропинов сообщалось об активности в отношении предварительно сформированных биопленок грамотрицательных патогенов (61, 62). Значение в промышленном производстве личинок черной солдатской мухи. Помимо противомикробного разработка лекарств, существует значительный интерес к использованию активных усилителей для других применений и отраслей промышленности. Усилители могут, например, использоваться в качестве добавок в сельском хозяйстве, пищевой и комбикормовой промышленности (63-65). BSFL изучаются в области обращения с отходами и переработки в животноводстве, например, при гигиенизации навоза (66-70). Уменьшение количества патогенных микроорганизмов в этих сильно загрязненных субстратах BSFL частично объясняется выработкой личинками усилителей (70). Кроме того, Усилители также могут быть полезны в самой индустрии насекомых. Разведение насекомых является процветающим сектором (71), и применение AMPS в сельском хозяйстве BSF может помочь снизить биологическую нагрузку, в том числе количество патогенных микроорганизмов человека, присутствующих в субстрате во время выращивания, биомассу насекомых и остатки (72, 73). Однако для превращения этих усилителей в полезные добавки необходимо провести дополнительные исследования стабильности этих пептидов, например, в субстрате, и возможных составов усилителей.
Заключительные замечания. В целом, выбранные нами пептиды кекропина показали многообещающие результаты активность в отношении грамотрицательных патогенов, таких как P. aeruginosa. Это открывает возможности для различных промышленных применений, включая разработку противомикробных препаратов. Поскольку усилители насекомых изучаются в качестве альтернативных методов лечения инфекций, таких как инфекции кожи, глаз и легких, эти кекропины BSF расширяют библиотеку пептидных матриц, используемых для разработки противомикробных препаратов (54). Однако многие другие аспекты, такие как синергизм с обычными антибиотиками, этих усилителей цекропина еще предстоит охарактеризовать (74,75). Кроме того, дальнейшее развитие должно будет устранить препятствия, обычно связанные с препаратами на основе пептидов, включая плохую метаболическую стабильность (4, 76).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Антимикробные пептиды. В предыдущем исследовании в транскриптоме H. illucens были идентифицированы гены, кодирующие предполагаемые усилители (8). Все усилители этого исследования, которые могли быть получены синтетическим путем, были получены методом твердофазного пептидного синтеза и очищены либо COVALAB (Брон, Франция), либо Proteogenix (Шильтигхайм, Франция) или Генскрипт (Лейден, Нидерланды). Для определения чистоты пептида использовали жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию. Тип пептида, аминокислотная последовательность, чистота, С-конец модификации, изоэлектрическая точка и молекулярная масса приведены в таблице S1. Для экспериментов пептиды растворяли в ДМСО (Acros Organics) в концентрации 10 мм и дополнительно разводили в стерильной деминерализованной воде. Бактериальные изоляты и условия культивирования. P. aeruginosa ATCC 9027, P. aeruginosa ATCC 15442, P. aeruginosa ATCC 15692 (PAO1), E. coli ATCC 8739, S. aureus ATCC 6538, K. pneumoniae ATCC 13883 и M. tuberculosis ATCC 25177 (H37Ra) были получены из ATCC (Коллекция культур американского типа, Манассас, Вирджиния, США). B. cenocepacia LMG 16656, P. aeruginosa LMG 27650, A. fumigatus B42928 и C. albicans B59630 были получены из бельгийских скоординированных коллекций микроорганизмов. Бактериальные штаммы (кроме M. tuberculosis) культивировали в бульоне Мюллера-Хинтона (MHB; Difco) и на Мюллере-Агар Хинтона (MHA; Сигма-Олдрич) или триптический соевый агар (TSA; Сигма-Олдрич). M. tuberculosis выращивали в полной среде Мидлбрука 7H9 (Сигма-Олдрич). Виды грибов были выращены в Розуэллском парке Мемориальный институт (RPMI; Gibco) средний.
Анализ антимикробной активности. Для выявления антимикробной активности BSF AMPS библиотека пептидов подверглась скринингу против группы микроорганизмов, состоящей из S. aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 8739, P. aeruginosa ATCC 9027, C. albicans B59630 и A. fumigatus B42928. Последовательные разведения пептидов готовили из исходных растворов ДМСО в стерильной деминерализованной воде в 96-луночных планшетах с использованием автоматизированной рабочей станции для обработки жидкостей (Beckman Coulter Biomek 3000) в конечных объемах 10 мл. Конечная концентрация ДМСО в пластине составляла 1%. Концентрации пептидов варьировались от 64 мм до 0,25 мм для первой оценки и от 32 мм до 0,016 мм для независимого повторения. В качестве ссылок использовались доксициклин (Sigma-Aldrich; S. aureus, E. coli, P. aeruginosa), флуцитозин (Sigma-Aldrich; C. albicans) и эконазол (Sigma-Aldrich; A. fumigatus). Суспензии исходного инокулята 5 10^3 КОЕ/мл (E. coli, S. aureus, C. albicans, A. fumigatus) и 5 10^4 КОЕ/мл (P. aeruginosa) были приготовлены в В 96-луночные планшеты добавляли среду MHB (бактериальные виды) или среду RPMI (грибковые виды) и 190 мл. Пластины инкубировали в течение 16 ч (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa), 24 ч (C. albicans) или 48 ч (A. fumigatus). при 37°C. После инкубации считывание антимикробной активности проводили с использованием анализа резазурина. Затем в каждую лунку добавляли 20 мл 0,01% (вес/объем) раствора резазурина (Сигма-Олдрич) и инкубировали планшеты в течение 15 мин (S. aureus), 30 мин (E. coli), 45 мин (P. aeruginosa), 4 ч (C. albicans) или 17 ч (A. фумигатус), чтобы обеспечить восстановление резазурина. Флуоресценцию считывали с помощью считывателя микропланшетов (Теликс) при возбуждении = 550 нм и пропускании = 590. Результаты были использованы для расчета значения IC50, определяемого как концентрация пептида, вызывающего 50%-ное ингибирование роста микроорганизмов. Значения MIC определялись визуально. Среду в лунках без визуального роста наносили на MHA для обнаружения MBC, определяемого как снижение логарифма на 3 доллара по сравнению с контролем роста. Скрининг библиотеки пептидов на цитотоксичность. Чтобы определить ранние признаки токсичности пептидов, библиотека была протестирована на клеточной линии MRC5-SV2 эмбриональных фибробластов легких человека (Sigma-Aldrich). Пептиды последовательно разводили в 96-луночных планшетах, как описано ранее, в концентрациях, варьирующихся от От 64 мм до 0,25 мм для первого скрининга и от 32 мм до 0,016 мм для независимого повторения. Тамоксифен (Сигма-Олдрич) был включен в качестве эталонного соединения. После приготовления тестовых пластин суспензию клеток (190 мл) 1,5 10^5 клеток/мл в полной минимальной эссенциальной среде (Gibco) подвергали добавляется к пептидам. Пластины инкубировали в течение 72 ч при 37°C в инкубаторе с 5% CO2 (связующее вещество). Затем в лунки добавляли 50 мл 0,01% (мас./об.) раствора резазурина (Сигма-Олдрич) для определения жизнеспособности клеток. После 4 ч инкубации флуоресценцию считывали с помощью считывателя микропланшетов (Telix) при возбуждении = 550 нм и пропускание = 590 и были рассчитаны значения IC50. Оценка отобранных кекропинов в сравнении с расширенной бактериальной панелью. Для дальнейшего изучения антимикробного спектра выбранных усилителей, антимикробный скрининг in vitro против дополнительных микроорганизмов был выполнен. Расширенная группа микробов включала P. aeruginosa PAO1, P. aeruginosa LMG 27650 (штамм с множественной лекарственной устойчивостью), P. aeruginosa ATCC 15442, K. pneumoniae ATCC 13883, B. cenocepacia LMG 16656 и M. tuberculosis H37Ra. Пептиды последовательно разводили в стерильной деминерализованной воде в 96-луночных планшетах с использованием автоматизированной рабочей станции для обработки жидкостей, как описано выше. Бактериальные суспензии готовили в концентрации 10^4 КОЕ/мл (K. pneumoniae), 5 10^4 КОЕ/мл (P. aeruginosa), 10^5 КОЕ/мл (B. cenocepacia) или 5 10^5 КОЕ/мл (M. tuberculosis). Кроме того, 190 мл этой суспензии смешивали с разведенными пептидами. Для скрининга M. tuberculosis наружные лунки тестовых пластин были заполнены 200 мл деминерализованной воды. В качестве ссылок, доксициклин (Сигма-Олдрич; P. aeruginosa PAO1, P. aeruginosa ATCC 15442, K. pneumoniae), сульфат полимиксина В (Сигма-Олдрич; P. aeruginosa LMG 27650), моксифлоксацин (Сигма-Олдрич; B. cenocepacia) и изониазид (Сигма-Олдрич; M. туберкулез) были использованный. Тестовые планшеты инкубировали при 37°C в течение 16 ч (P. aeruginosa, K. pneumoniae), 48 ч (B. cenocepacia) или 7 дней (M. tuberculosis) и считывали антимикробную активность с помощью анализа на резазурин, как описано ранее. Пластины с резазурином инкубировали 15 мин (K. pneumoniae), 30 мин (P. aeruginosa), 4 ч (B. cenocepacia) или 1 день (M. tuberculosis). Флуоресцентный сигнал считывался с помощью считывателя микропланшетов (Промега) при возбуждении = 550 нм и пропускании = 590 и были рассчитаны значения IC50.
Анализ гемолиза. Для анализа гемолиза свежую цельную кровь человека собирали в пробирки, содержащие 30 единиц гепарина (77). Затем кровь центрифугировали (1000 г, 5 мин) и промывали до тех пор, пока супернатант не стал прозрачным. Гранулы эритроцитов разводили в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS; Gibco) для получения 2% суспензии эритроцитов. Затем 150 мл последовательно разведенных АМПЕР в PBS 0,1% Тритон-Х (Сигма-Олдрич) и PBS использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Образцы инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Затем пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин и 200 мл надосадочной жидкости переносили на 96-луночный планшет. Поглощение измеряли с помощью считывателя микропланшетов (Promega) при l = 570 нм для определения выделения гемоглобина. Анализ на гемолиз проводился дважды. Кроме того, гемолиз был предсказан с помощью онлайн-программного обеспечения HemoPred (36).
Анализ времени, чтобы убить время. Для исследования бактерицидной кинетики выбранных усилителей был проведен анализ времени до уничтожения, как описано ранее Маскио и др. (78). Кратко, пептид серийные разведения подготовлен в 96-луночных планшетах (10 мл) и смешивают с 190 мл в культуре клеток P. aeruginosa АТСС 9027 оптического плотность измеряли при длине волны 600 Нм (OD600) в размере 0,1. Плиты инкубировали при 37°C и в выбранные моменты времени (0 ч, 0,5 ч, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 5 ч), аликвоты были удалены и серийно разводили в PBS. Разведения наносили на TSA и инкубировали в течение ночи при 37°C. После этого жизнеспособность бактерий оценивали путем выполнения стандартного подсчета пластин. Бактерицидная активность была определена как снижение на 3 логарифма по сравнению с необработанным бактериальным контролем. Чтобы избежать эффекта переноса пептидов, неразбавленный образец не покрывали, что приводило к пределу количественной оценки 10^3 КОЕ/мл (78). Количество бактерий рассчитывали для каждой концентрации AMP в каждый момент времени, используя среднее количество пластин. После этого войдите в систему 10 уменьшение количества бактерий рассчитывали по следующей формуле: уменьшение log10 = log10 (жизнеспособные микроорганизмы без обработки AMP/жизнеспособные микроорганизмы с обработкой AMP). Затем были рассчитаны и визуализированы средние сокращения log10 и стандартные отклонения пяти независимых экспериментов с использованием GraphPad Prism 8.
Ингибирование образования биопленки. Чтобы исследовать влияние усилителей на образование биопленки, последовательно разведенные пептиды добавляли в duplo в 96-луночные планшеты с конечными концентрациями в диапазоне от 64 до 0,5 мм. Затем была добавлена культура P. aeruginosa ATCC 15442 приблизительно 10^6 КОЕ/мл. После 16 часов инкубации при 37°C и встряхивания при 110 об/мин (New Brunswick Innova 4300) использовали анализ на резазурин, как описано Gilbert-Girard и др. для определения жизнеспособности бактериальных клеток в биопленке (79). После инкубации питательную среду удаляли из лунки, а бактериальные биопленки один раз промывали PBS для удаления оставшихся планктонных клеток. Затем 200 мл 20-миллиметрового раствора резазурина добавляли в каждую лунку, и пластины инкубировали 4 ч при 37°C при перемешивании при 110 об/мин (новый Брансуик Иннова 4300). Флуоресценцию лунок измеряли при возбуждении = 550 нм и пропускании = 590 с помощью считывателя микропланшетов (Promega). Затем было применено окрашивание кристаллическим фиолетовым для определения биомассы биопленок (79). Раствор резазурина удаляли из лунки и добавляли 200 мл 100% этанола (VWR Chemicals) для фиксации биопленок. После 15 минут инкубации этанол был удален из лунок, и пластины были оставлены для высыхания на воздухе в течение 30 минут. Затем к биопленкам добавляли 200 мл 0,023% (мас./об.) раствора кристаллического фиолетового (Merck). Окрашивающий раствор удаляли через 5 мин, а биопленки промывали PBS. После сушки на воздухе в течение 10 мин кристаллическое фиолетовое пятно растворили в 200 мл 100% этанола. Поглощение измеряли при l = 595 нм с помощью считывателя микропланшетов (Promega) и, по возможности, рассчитывали значения IC50. Эксперимент проводился три раза. Сульфат полимиксина В (Сигма-Олдрич) был включен в качестве эталона.
Уничтожение биопленки (постэкспозиция). В дополнение к образованию биопленки, было исследовано влияние пептидов на предварительно сформированные биопленки для измерения степени уничтожения биопленки. P. aeruginosa ATCC 15442 биопленки были выращены в 96-луночных планшетах, как описано выше, без добавления усилителей. После ночной инкубации среду удаляли и 10 мл последовательно разведенных пептидов добавляли в duplo в планшеты в концентрациях от 128 мм до 0,5 мм (конечная концентрация). Был добавлен новый MHB, и лунки снова инкубировали в течение 16 ч при 37°C и встряхивании при 110 об/мин (новый Брансуик Иннова 4300). На следующий день жизнеспособность и биомассу бактерий определяли с помощью анализа на резазурин и анализа на кристаллический фиолетовый, как описано ранее. Эксперимент проводился трижды. Сульфатполимиксина В был включен в качестве эталона. Проницаемость внутренней мембраны с помощью анализа поглощения йодида пропидия. Для исследованияповреждения IM, вызванного выбранными усилителями, был проведен анализ поглощения PI (Сигма-Олдрич), адаптированный из Дассанаяке и др. (80). P. aeruginosa ATCC 9027 выращивали до середины логарифмической фазы в MHB. Бактерии были центрифугированы (3000 г, 15 мин) и ресуспендированы в 5 мм буфере HEPES (Сигма-Олдрич) (рН 7,4) до OD600 0,5. Затем 50 мл последовательно разведенных пептидов добавляли в duplo в 96-луночный планшет и смешивали со 150 мл бактериальной суспензии, содержащей 4 мм PI (конечная концентрация в планшете 3 мм). Тестовые концентрации пептидов варьировались от 32 мм до 0,25 мм. В качестве положительного контроля использовали высокую концентрацию сульфата полимиксина В (16 мм). Флуоресценцию измеряли каждые 5 мин в течение 1 ч с помощью считывателя микропланшетов (Promega) при длине волны = 530 нм и пропускании = 620. Данные были нормализованы на основе флуоресцентного сигнала в присутствии 50 мл буфера HEPES и 150 мл бактериальной суспензии PI. Анализ был проведен в трех экземплярах.
Проницаемость наружной мембраны с помощью N-фенилнафтиламина. N-фенилнафтиламин (NPN; Токийская химическая промышленность [TCI]) использовалась для изучения проницаемости OM, как описано Хеландер и др. (81). Вкратце, P. aeruginosa ATCC 9027 выращивали до середины логарифмической фазы в MHB. Затем клетки центрифугировали (3000 г, 15 мин) и ресуспендировали в 5 мм буфере HEPES (рН 7.4) до OD600 0,5. Затем 50 мл пептидов добавляли в duplo в 96-луночный планшет (конечные концентрации варьировались от 32 мм до 0,25 мм). В качестве положительного контроля был включен 16 мм полимиксин В. Пептиды смешивали с 50 мл 40 мм раствора NPN и 100 мл суспензии P. aeruginosa. Флуоресценцию измеряли каждые 5 мин в течение 1 ч с помощью считывателя микропланшетов (Promega) с лексикографией =350 нм и пропускание = 420. Данные были нормализованы на основе флуоресцентного сигнала в присутствии 50 мл буфера HEPES, 50 мл NPN и 100 мл бактерий. Эксперименты проводились в трех экземплярах.
Анализ деполяризации цитоплазматической мембраны. Для изучения влияния пептидов на мембранный потенциал использовали иодид 3,39-дипропилтиадикарбоцианина (DISC3(5); TCI), как описано Kwon et al. (82). P. aeruginosa ATCC 9027 выращивали до фазы среднего логарифма в MHB. После этого клетки Ван Молл и др. Объем центрифугировали (3000 гр, 15 мин.), промывают и снова суспендируют в 5 мм буфера HEPES (рН 7,4) с добавлением с 20 мм глюкозы и 100 мм Ксl до OD600 на 0,2. DiSC3(5) был добавлен клеток P. aeruginosa ходовая часть в концентрации 1.33 мм (финал в-плиты концентрация 1 мм), и смесь остался стоять за 1,5 ч до стабилизации сигнала флуоресценции. Последовательно разведенные пептиды (50 мл) добавляли в duplo в 96-луночные планшеты (конечные концентрации варьировались от 32 мм до 0,25 мм) и смешивали со 150 мл бактерий с diSC3(5). Флуоресцентный сигнал измеряли при lexcitation = 620 нм и пропускании = 670 с помощью считывателя микропланшетов (Promega) каждые 5 мин в течение 1 ч. Кроме того, в качестве положительного контроля использовали 0,1% Triton-X. Данные были нормализованы на основе флуоресцентного сигнала в присутствии 50 мл добавленного Буфер HEPES и 150 мл diSC3(5) -бактериальная суспензия. Анализ был проведен в трех экземплярах.
Статистический анализ. Для экспериментов с биопленкой тест множественного сравнения T3 Даннетта был используется для сравнения средних значений обработанных групп со средним значением необработанного контроля (графическая панель Призма 8).
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ
Дополнительные материалы доступны только в Интернете.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ФАЙЛ 1, PDF-файл, 0,3 МБ.
https://journals.asm.org/doi/pdf/10.1128/spectrum.01664-21
In Vitro Evaluation of Antimicrobial Peptides from the Black Soldier Fly (Hermetia Illucens) against a Selection of Human Pathogens (
asm.org)
https://journals.asm.org/doi/pdf/10.1128/spectrum.01664-21
Нет комментариев